【摘要】 目的 探讨实验性兔晶体氧自由基损伤与白内障的发病机制。方法 利用近距离紫外线（ultraviolet,UV）照射体外培养兔晶体，诱发氧自由基损伤。并同时观察超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）的抗氧化作用。实验分为UV照射组、UV+SOD组及对照组，采用硫代巴比妥酸比色法分别检测三组晶体匀浆中脂质过氧化产物丙二醛含量，并通过透射电镜观察三组晶体上皮细胞的超微结构。结果 UV照射组兔晶体匀浆中的丙二醛含量明显增高。UV+SOD组（UV照射前1小时，在培养液中预先加入SOD 10 U/ml孵育）未见丙二醛含量增高。电镜观察: UV照射组上皮细胞膜、线粒体等膜性结构破坏较重，多数结构消失，核染色质凝结成块。UV+SOD组，胞膜完整，细胞结构清晰可见。与对照组大致相同。结论 近距离紫外线可诱发培养兔晶体的脂质过氧化反应及晶体上皮细胞损伤。
【关键词】 紫外线 过氧化脂质 晶体 A study of lipid peroxide-induced damage and of ultrastructure of lens epithelial cells in lens organ culture in vitro Kang Jieni, Zhang Jingsong, Zhao Yanni. The PLA Dalian Junior College of Medicine, Dalian 116013
【Abstract】 Objective To understand the mechanism of the rabbit lens damage from lipid peroxidation (LPO) involved in cataract development. Methods Ultraviolet (UV) radiation was used to induce the damage of peroxidation on cultured rabbit lens. Cultured rabbit lenses were exposed to UV radiation in MEM cultural medium without or with superoxide dismutase (SOD) added at 10 U/ml. The thiobarbituric acid (TBA) colorimetric method was used to detect the lens malondialdehyde (MDA) content produced by LPO, and electron microscopy was used to observe the ultrastructure of rabbit lens epithelium. Results In the lens with UV radiation, MDA was increased as compared with that in non-irradiated one (P<0.01) and in UV + SOD group (P<0.01). The membranes of lens epithelial cells were damaged and mitochondria, etc. membranous structures disappeared with clumping pattern of chromatin, while the cells in UV+SOD and control groups appeared normal in structure.Conclusion UV radiation can induce lipid peroxide damage in lens culture of rabbit.
【Key words】 Ultraviolet Lipid peroxidation Lens 白内障的发病机制一直是各国学者关注的课题。随着自由基医学的深入发展，大量的实验证实白内障的发生与自由基导致的脂类过氧化密切相关［1～3］，流行病学调查表明，紫外线幅射可致晶体混浊［4］。我们通过近距离紫外线（ultraviolet, UV）照射培养的兔晶体产生的脂质过氧化产物的测定，以及对其晶体上皮细胞的超微结构观察，为进一步探讨白内障的发生机制提供实验依据。材料与方法 一、实验动物及晶体培养 家兔20只（中国医科大学动物实验中心提供），雌雄兼用，体重1.5～2.5 kg，健康无眼疾。处死后，立即摘取眼球，置于每500 U/100 ml抗生素生理盐水中冲洗。无菌无损伤条件下剥离晶体，放入每孔盛有10 ml MEM培养液（含10%小牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素0.1 mg/ml）的六孔培养板（美国产）内，置37℃、95%湿度、5%CO2孵箱中培养，隔日更换一次培养液。 二、近距离紫外线照射诱发自由基系统 近距离紫外线源选用200 W高压汞灯（沈阳华光灯泡厂产，经辽宁省计量测试技术研究所测定其光谱能量集中于300、315及365 nm处，为UV-A、UV-B混合光源），参照Ahuva法［5］与Zigman法［6］将培养48小时的兔晶体（透明无混浊）置于垂直光源下方50 cm处，撤去培养板盖，晶体表面上液保留约1 mm，其余培养液移走。近距离UV+超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）组，照前1小时预先加入SOD 10 U/ml孵育，照射时间为10分钟，照射生物剂量为5个MED（MED即在该光源正下方50 cm处照射健康成人手臂腹侧皮肤2分钟，可产生一个最小红斑剂量）。对照组同条件下同室无UV幅射处。 三、丙二醛含量测定 将近距离紫外线照射后的晶体与对照组晶体，称湿重后，冰浴下制备晶体组织匀浆。取组织匀浆液0.2 ml加入2.5%醋酸溶液1.5 ml，0.67%硫代巴比妥酸溶液1.5 ml，置于旋涡式振荡器上充分混匀。放入95℃水浴中，1小时后取出，即入冰浴中终止反应。冷却后，加正丁醇4 ml，充分振荡混匀，离心15分钟，（3 000 r/min）分层，吸取正丁醇吡啶层，测定其光密度值（国产721分光光度计），计算丙二醛含量。统计学处理采用t检验。 四、透射电镜标本制备 将实验处理后的三组晶体，分别沿赤道部完整剪下晶体前囊，放入2.5%戊二醛固定液中固定1周后，用pH 7.4二甲砷酸钠缓冲液冲洗，1%锇酸固定1小时后再冲洗，用乙醇-丙酮进行梯度脱水，树脂包埋后制成透射电镜标本。LKB-V超薄切片机切片，铀-铅双重重金属染色。于透射电镜（日立H-600）下观察其超微结构。结果 一、三组不同处理因素的兔晶体脂质过氧化产物丙二醛含量 如附表所示，UV照射组与对照组比较，丙二醛含量明显增高，差异有显著性（P<0.01）；与UV＋SOD组比较，差异有显著性(P<0.01)。附表 不同处理因素的兔晶体丙二醛含量比较
组别 晶体数 丙二醛含量( ,nmol/mg*pro)
UV照射组 8 0.012 40±0.002 35
对照组 8 0.007 94±0.000 59
UV+SOD组 8 0.002 89±0.002 25
二、透射电镜观察 UV照射组显示明显的细胞损伤，亚细胞结构大部分消失，核染色质凝结成块状(图1)。UV+SOD组可见正常晶体上皮细胞形态，胞膜完整，胞浆内亚细胞结构大多可见，细胞间连接紧密（图2，3）。对照组细胞大致正常（图4）。超微结构观察表明，UV照射组与对照组及UV+SOD组比较，有明显区别。 图1 胞膜破坏（实箭头），细胞内大部分结构消失，线粒体肿胀，核染色质疑集成块壮（TEM×4 000） 图2 细胞排列整齐，可见大量线粒体（空箭头），细胞间头桥粒连接（实箭头）、核染色质呈细颗粒壮，核膜完整（TEM×3 500） 图3 细胞内线粒体（空箭头）、内质网（实箭头）丰富（TEM×12 000） 图4 胞浆内头肿胀的线粒体（实箭头）（TEM×3 000）讨论 紫外线波长在320 nm以下的（UV-B）主要被角膜吸收，而波长320～400 nm（UV-A）则绝大部分被晶体吸收。在夏天，地球温带地区每天中午，每小时可接受约3 500 kJ/m2紫外线（波长320～400 nm）的照射［5］。Rosenthal等［7］证实，日光中的UV约2%～17%的能量能够到达人眼。因此，在阳光下曝露1小时，则有约42～356 kJ/m2的UV-A能量到达人眼的晶体上皮细胞，使其产生光化学反应，光解晶体细胞内色氨酸，产生N-甲酰犬尿酸。后者作为内源性光敏剂，可多途径产生活性氧自由基（羟基HO*，超氧阴离子O2，单线态氧＇O2），使晶体纤维及上皮细胞遭受双重氧化应力的损伤［8］。而产生的HO*，O2和＇O2可进一步损伤晶体。其途径为：对细胞膜及膜性结构的破坏；通过HO*、O2及＇O2作用于细胞脂质或生物膜中磷脂等所含的多价不饱和脂肪酸，使之发生脂质过氧化反应，从而使生物膜等功能障碍。其产物丙二醛被认为是脂类过氧化过程中的重要产物。同时，过氧化过程中还可以产生多种新的活泼的自由基，攻击细胞中的酶和其它成分。损伤途径还可以通过对蛋白质和酶的破坏以及直接对核酸和染色体的损伤等［9］。以上机制已在本实验中得到进一步证实。本研究通过UV照射及添加抗氧化剂（SOD）的实验结果表明，在近距离紫外线照射后，晶体产生脂质过氧化反应。电镜结果表明：UV损伤晶体的途径很可能是双重途径的影响，即通过氧自由基对细胞膜及细胞膜性结构的破坏，亦通过其对蛋白质、酶以及直接损伤染色体的作用，因而影响全部细胞的功能。 晶体上皮细胞是晶体内代谢最活跃的部位，具有晶体的生长、分化和修复等功能，并为其代谢提供能量。晶体上皮细胞参与前囊内外离子的转运，维持囊膜内外的离子梯度，从而使晶体纤维排列整齐、均匀。以上这些功能均有赖于晶体上皮细胞间的紧密连接、上皮细胞的形态完整和功能正常。因此，对晶体上皮细胞的任何损害，均可影响晶体的正常生理功能，致使水分在晶体内潴留，最终导致白内障发生。 本实验中，我们对三组共36张电镜标本观察后发现：UV照射组和对照组上皮细胞内线粒体、酶等膜性结构多有变形、破坏，而UV+SOD组的全部细胞形态、亚细胞结构明显好于前两组。可以认为，SOD的抗氧化作用还可体现在保护晶体上，在晶体培养上起到了保护因子的作用。本实验的意义还在于体外培养晶体与培养细胞比较，更简便易行，细胞存活、生长、代谢同样接近于生理条件，而且施加实验处理因素亦较方便、可行。实为在分子水平上探讨白内障发病机制以及临床筛选抗氧化剂提供了一条可行途径。 参考文献 1 Frederikse PH， Garland D， Zigler JS Jr， et al. Oxidative stress increases production of beta-amyloid precursor protein and beta-amyloid(Abeta) in mammalian lenses, and Abeta has toxic effects on lens epithelial cells. J Biol Chem, 1996,271:10169-10174. 2 Babizhayev MA,Costa EB. Lipid peroxide and reactive oxygen species generating systems of the crystalline lens. Biochim Biophys Acta,1994,1225:326-337. 3 Mibu H, Nagata M, Hikida M. A study on lipid peroxide-induced lens damage in vitro .Exp Eye Res,1994,58:85-90. 4 Sheila KW, Charles TV. 老年性白内障危险因素的流行病学.丁传庆节译.国外医学眼科学分册，1996，20：26-29. 5 Dovrat A, Weinreb O. Recovery of lens optics and epithelial enzymes after ultraviolet A radiation. Invest Ophthalmol Vis Sci ，1995，36:2417-2424. 6 Zigman S, McDaniel T, Schultz JB, et al. Damage to cultured lens epithelial cells of squirrels and rabbits by UV-A (99.9%) plus UV-B(0.1%) radiation and alpha tocopherol protection. Mol Cell Biochem， 1995，143:35-46. 7 Rosenthal FS, Phoon C, Bakalian AE, et al. The ocular dose of ultra-violet radiation to outdoor workers. Invest Ophthalmol Vis Sci，1988，29:649-656. 8 Weiter JJ, Subramanian S. Free radicals produced in human lenses by a biphotonic process .Invest Ophthalmol Vis Sci， 1978，17:869-873. 9 陈为亨. 眼光性损伤的自由基机理(综述). 国外医学眼科学分册， 1992，16：199-203. 作者单位：116013 解放军大连医学高等专科学校专科教研室(康洁霓)；中国医科大学第一临床学院眼科(张劲松)，细胞生物电镜室(赵燕妮